国内常见多种狂犬病毒株如何预防？新型PIKA佐剂疫苗，可能是潜在的优化选择…

每年约有59,000人因狂犬病而丧生，其中大多数死亡事件发生在普遍存在通过狗传播的狂犬病的亚洲、非洲地区。对于严重的暴露事件，如经皮叮咬、黏膜污染或动物唾液破损，以及直接接触蝙蝠，强烈建议进行暴露后预防措施。暴露后预防（PEP）的过程包括对伤口进行清洁，并在特定的时间间隔内皮内或肌肉内注射狂犬病疫苗（相关阅读：狂犬病暴露预防处置工作规范（2023年版））。在更严重的情况下，可以通过注射人源或马源狂犬病免疫球蛋白来处理伤口。

狂犬病的病原体属于横纹病毒科中的溶血病毒属。狂犬病病毒（RABV）是一种RNA病毒，其常规复制过程中容易发生突变。过去的研究已经确定了全球范围内的11个抗原性变体。通过对G蛋白和N序列的核苷酸进行系统发育分析，中国地区流行的7个初级支系（I~VII）已得到鉴定。密切观察流行病毒株的抗原变异对于疫苗和治疗方法的开发至关重要。

目前，灭活疫苗是目前最常使用的狂犬病疫苗。然而，该疫苗存在一些局限性，包括免疫原性不足和炎症反应较弱，而炎症反应对于有效的T和B细胞介导的免疫反应至关重要。此外，这些疫苗的复杂给药方案也增加了免疫的成本。为了简化接种过程并降低成本，迫切需要开发一种安全、有效且所需剂量较少的新型狂犬病疫苗。

曾有研究发现，在狂犬病疫苗中添加一种名为PIKA佐剂的新型佐剂可以产生令人振奋的效果。PIKA佐剂是一种化学稳定的双链RNA类似物，可以激活非特异性免疫反应。通过激活Toll样受体3(TLR-3)，PIKA佐剂改变了抗原呈递细胞（APC）的抗原呈递方式，导致促炎细胞因子的升高。与非佐剂狂犬病疫苗相比，PIKA疫苗能够产生更高水平的狂犬病病毒中和抗体（RVNA）和更强的细胞免疫能力——PIKA佐剂疫苗对所有狂犬病病毒株（包括中国地区的I至VI型）都有更广泛的保护作用，并且可以更快地产生RVNA和更强的T细胞反应。因此，PIKA佐剂狂犬病疫苗可作为狂犬病暴露后的预防措施。近期，有研究团队对PIKA佐剂狂犬病疫苗的免疫效果进行了研究，结果发表于Vaccine期刊。

doi:10.1016/j.vaccine.2023.10.001.

结果汇总

经过试验发现，对于感染中国流行的7株狂犬病的小鼠而言，在不使用免疫球蛋白的情况下，保护效果超过80%。相比之下，PIKA狂犬病疫苗的接种仅5天后，中和抗体水平显著提高，超过了特许狂犬病疫苗诱导的免疫反应。

1.PIKA狂犬病疫苗可有效保护感染七种RABV的小鼠

该研究在BALB/c小鼠上进行了一系列暴露后试验，评估了PIKA佐剂狂犬病疫苗对不同狂犬病病毒分支的保护效果。研究发现，获得获批的狂犬病疫苗可以有效预防某些毒株，但对其他毒株的预防效果有限。相比之下，PIKA狂犬病疫苗对所有主要狂犬病分支提供广泛的保护，接种鼠疫疫苗的小鼠存活率超过80%（图1）。

图1.狂犬病感染小鼠在受到七种狂犬病毒株攻击后的存活率

(a)BALB/c小鼠研究设计流程图。

(b-h)在QH2株（中国四号）、SC16株（中国一号）、LY株（中国五号）、YN3株（中国六号）、XZ17株（中国七号）、NM3株（中国三号）和GD1株（中国二号）暴露后，绘制存活率曲线。

各试验组之间的比较采用对数等级检验（ns，不显著；*p<0.001；**p<0.01；*p<0.001）。

2.PIKA狂犬病疫苗促进交叉中和七种不同RABV的能力

研究发现，接种PIKA狂犬病疫苗的小鼠在免疫后的第五天，产生的中和抗体水平超过了对人类、狗和猫的保护阈值。相比之下，接种获批疫苗的小鼠的抗体滴度未达到相同水平。此外，PIKA佐剂疫苗对不同狂犬病病毒株表现出更高的中和效果。这些结果表明，与获批疫苗相比，PIKA佐剂疫苗可能提供更强的对各种狂犬病病毒株的保护效果（图2）。

图2.PIKA佐剂促进中和抗体的产生

小鼠通过肌肉注射PIKA狂犬病疫苗（遵循2-2-1方案）或特许狂犬病疫苗（遵循Essen方案）。

(a&b)于初次免疫后第3、5、7、10、14天采集血清标本。用RFFIT试验评估狂犬病病毒中和抗体水平。

(c-i)于初次接种后第7天采集血清。用不同毒株检测狂犬病病毒中和抗体水平。

平均±SEM值的显著水平分别为*p<0.005、**p<0.001。

3.PIKA狂犬病疫苗促生强烈的Th-1体液免疫反应

根据实验结果，第0天和第7天给小鼠注射PIKA狂犬病疫苗和非佐剂狂犬病疫苗后，PIKA狂犬病疫苗在小鼠体内引起的抗原特异性免疫球蛋白水平明显高于非佐剂疫苗。PIKA组产生的IgG2a抗体水平显著高于非佐剂组，并且两组的IgG2a/IgG1比率都大于1，表明它们更倾向于Th1应答。

4.PIKA狂犬病疫苗诱导针对该抗原的强烈T细胞免疫反应

研究结果显示，接种PIKA狂犬病疫苗后，T细胞产生的干扰素数量显著高于获得获批的灭活疫苗组。在接种后的第10天，两组之间的差异更明显。这表明PIKA狂犬病疫苗能更快、更有效地刺激T细胞免疫反应（图3）。

图3.接种PIKA狂犬病疫苗与非佐剂狂犬病疫苗的体液和细胞免疫反应

BALB/c小鼠肌肉注射PIKA狂犬病疫苗或非佐剂狂犬病疫苗。在第21天采集血样，以确定特定的抗体反应。用双抗体夹心法测定血清中抗RABV抗体的水平，包括lgG(a)、lgG1(b)和lgG2a(c)，以及lgG2a/lgG1比值(d)。(e&f)免疫后第0、3、7、10天用RABV抗原重新刺激脾细胞，用ELISPOT法检测脾细胞释放干扰素IFN-γ的能力。在(e)中展示的是IFN-γ在每一类别中的代表性插图。

实验组间比较采用t检验(*p<0.001；**p<0.01；*p<0.05)。

5.PIKA狂犬病疫苗可增加注射部位炎性细胞因子的释放

疫苗注射后的炎症反应可以促进免疫细胞的招募，进而引发强大的免疫反应。联合应用抗原和PIKA注射可以显著增加炎性细胞因子的释放，潜在地增强对疫苗的免疫反应。

图4.注射部位细胞因子的产生

用狂犬病抗原和PICA佐剂、单独狂犬病抗原、PICA佐剂或PBS肌肉注射的方法接种BALB/c小鼠。注射后24小时切除注射部位。提取、逆转录、扩增总RNA后进行实时荧光定量聚合酶链式反应。

平均值±扫描电子显微镜是作为数据提供的。

实验组间比较采用单因素方差分析，显著性水平分别设为*p<0.001、**p<0.01和*p<0.05。

6.PIKA狂犬病疫苗可诱导强健的非特异性免疫反应

在狂犬病感染的初始阶段，非特异性免疫反应可能在清除病毒感染方面发挥作用。一项研究使用Luminex平台检测了三种狂犬病疫苗引起的非特异性免疫反应。研究结果显示，相较于经批准的疫苗组，PIKA疫苗组和PIKA佐剂组在免疫后8小时表现出更高水平的细胞因子和趋化因子的表达。干扰素-α的浓度在PIKA疫苗组初始免疫后达到峰值，但在第二次免疫后显著下降。总的来说，这些发现表明，非特异性免疫反应在限制病毒传播并为特异性免疫反应争取时间方面扮演着重要角色（图5）。

图5.用多重技术分析BALB/c小鼠血清中细胞因子的表达

通过肌肉注射PIKA狂犬病疫苗(PR，2-2-1计划)、获批狂犬病疫苗(LR，Essen计划)或PIKA佐剂(PA，2-2-1计划)对小鼠进行免疫。分别于注射后8、24h取血清，Luminex多重分析法检测细胞因子的表达。

(a)细胞因子在血清中表达的热图可视化。细胞因子按行表示，样本按列表示。为了考虑细胞因子表达的变化，通过将最小浓度设置为0和最大浓度设置为1来归一化数据，并按行组织。

检测(b)血清干扰素-α、(c)白介素6和(d)CXCL1水平。每组6人。

平均值±扫描电子显微镜是作为数据提供的。

实验组间比较采用单因素方差分析，显著性水平分别设为*p<0.001、**p<0.01和*p<0.05。

7.PIKA的佐剂性能主要由TLR3介导

为探讨PIKA佐剂对免疫细胞的影响，将TLR3-/-小鼠和野生型小鼠的脾细胞分别在加和不加PIKA卡佐剂的条件下进行培养。如图7所示，与TLR3-/-小鼠相比，野生型小鼠接种PIKA疫苗后，CD69+CD4T细胞、CD69+CD8T细胞和CD86+DC的百分比显著增加。在TLR3-/-和野生型小鼠中，发现对内毒素的反应是相似的。结果提示，PIKA佐剂可诱导CD4T细胞、CD8T细胞和DC的活化，TLR3在这些细胞对PIKA佐剂的应答中起关键作用。

图6.PIKA佐剂(100μg/只)免疫后TLR3-/-小鼠血清中细胞因子的表达分析

注射后2h取血清，Luminex多重分析法检测细胞因子的表达。检测血清IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IFN-γ、IL-12p70、GM-CSF、TNF-α、IL-18水平。N=每组5例。

平均值±扫描电子显微镜是作为数据提供的。

组间比较采用t检验(*p<0.001；**p<0.01；*p<0.05)。

图7.PICA佐剂诱导TLR3缺陷小鼠免疫细胞的激活

取TLR3-/-和野生型小鼠的脾细胞在PIKA(100μg/ml)存在或不存在的条件下培养24h，同时以脂多糖(10ng/ml)作为对照。流式细胞仪检测CD69(A)、CD8+T细胞(B)、DC(C)和巨噬细胞(D)表达CD69(A)的比例。

PIKA狂犬病疫苗的接种可显著协同增加对该抗原产生干扰素-γ的T细胞数量。同时，在注射部位观察到IL-1β、IL-6、CCl-2和肿瘤坏死因子-α水平升高。接种PIKA狂犬病疫苗后，血清中趋化蛋白和促炎分子水平也有所增加。通过在TLR3基因敲除小鼠上进行的实验进一步证实了PIKA的作用机制，证明其佐剂功能依赖于TLR3途径。这些结果均表明，PIKA狂犬病疫苗具有潜力作为一种高效方法，大大提高了狂犬病疫苗的效力。

讨论与分析

狂犬病是一种在全球广泛传播的致命传染病。目前，现有的灭活疫苗在免疫原性方面表现不理想，需要多次接种才能有效。在过去几年中，人们进行了广泛的研究，致力于开发新型、可靠和有效的狂犬病疫苗。这些包括基于重组病毒载体的疫苗、DNA和RNA的疫苗、狂犬病弱毒活疫苗和重组蛋白疫苗。研究表明，利用PIKA佐剂的狂犬病疫苗可以提供强大而全面的保护。

PIKA疫苗对中国境内的七种狂犬病病毒株的保护率超过80%，弥补了狂犬病免疫球蛋白的所不能及的空白。与目前获批狂犬病疫苗相比，PIKA狂犬病疫苗能够更快速、更强力地诱导中和抗体的产生，增强抗原特异性的细胞免疫反应，迅速激活非特异性免疫反应，并显著增加了注射部位和血清中的炎症因子、细胞因子和趋化因子的产生。PIKA佐剂的佐剂功能主要归因于TLR3途径，这一点已经通过在TLR3基因敲除小鼠上的实验得到了证实。这些发现证实PIKA佐剂能够极大地提升疫苗效力，显示出PIKA狂犬病疫苗作为一种高效疫苗的潜力。

NEXT

狂犬病病毒（RABV）具有在复制过程中容易发生频繁突变的特质。通过系统分析，研究确定了中国的七个主要支系（I~VII）。中国的地理范围广泛，境内流传的狂犬病毒品系，涵盖了所有品系的80%以上，零散分布在19个省份。先前的研究已经调查了来自不同地理位置的RABV分离株的传染性、抗原性和系统发育关系。虽未观察到它们之间的显著关联性，但该研究确定了对传染性或抗原性产生影响的特定突变。研究发现，单个氨基酸突变可能会导致抗原性和传染性的变化。随着时间的推移，基因变异的积累可能会潜在地影响免疫效果。

研究发现，现已获批的狂犬病疫苗在不同狂犬病病毒群中所提供保护水平的程度不同，有一种解释是，获批疫苗和测试用途的病毒菌株之间存在关键氨基酸序列差异。而PIKA佐剂狂犬病疫苗对这些毒株均有免疫效果，可能是因为PIKA佐剂可以迅速激发更广泛的中和抗体和强大的非特异性免疫反应。

研究人员已经证明，在清除中枢神经系统中的狂犬病病毒方面，Th1免疫反应起着至关重要的作用。PIKA狂犬病疫苗在BALB/c小鼠中成功诱导了强大的Th1偏向免疫反应。此外，它还能够引发大量针对狂犬病抗原的T细胞反应。这些结果表明，PIKA狂犬病疫苗可能通过激发针对特异性抗原的T细胞反应而展现出强大的保护效果。

接种狂犬病疫苗后之所以能够更有效地清除病毒，其机制在于能够更早和更快地引发免疫反应，但不受控制的过度免疫反应可能导致病理性免疫。研究发现，PIKA狂犬病疫苗能够迅速引起先天免疫反应，这种激活状态是短暂的。动物毒理学研究结果表明，这种暂时性的先天免疫反应不易对生物体造成长期伤害。

干扰素是人类漫长抗病毒斗争史中的中流砥柱，具有强大的抗病毒、抗肿瘤、抗增殖和免疫调节特性。干扰素能够增加血脑屏障的通透性，有助于免疫制剂渗透到中枢神经系统，以清除狂犬病病毒。但狂犬病毒现已经发展出多种机制来逃避免疫系统的攻击，抑制干扰素的分泌，确保自身的存活和病毒的复制。相较于无毒株，RABV强毒株在抑制干扰素产生方面表现更为高效。这种差异解释了这两种菌株之间的致病性差异。研究发现，相较于灭活疫苗，PIKA狂犬病疫苗能够诱导小鼠脾细胞分泌更多的IFN-γ，并迅速诱导I型和II型干扰素的产生。PIKA狂犬病疫苗通过激活干扰素途径发挥强大的保护作用。TLRs作为免疫反应中的重要受体，其中TLR3在识别病毒双链RNA并启动免疫反应中发挥着关键作用。PIKA佐剂作为一种合成的双链RNA类似物，通过激活TLR3，能够增加血清中细胞因子的产生，并激活多种免疫细胞。

研究结果总体表明，相较于经获批的狂犬病疫苗，PIKA佐剂狂犬病疫苗能够提供更广泛和更强的保护效果。PIKA疫苗对中国目前存在的七种狂犬病病毒株均具备80%以上的效力，无需依赖狂犬病免疫球蛋白。接种PIKA疫苗能够迅速激发大量中和抗体的产生，增强对抗原的特异性免疫反应和非特异性反应，并促进体循环和注射部位炎症因子、细胞因子和趋化因子的释放。研究表明，TLR3信号是PIKA佐剂疫苗有效性的关键因素，该结论得到了使用TLR3缺陷小鼠的实验证据支持。根据研究结果，PIKA狂犬病疫苗具备有效和有希望的预防狂犬病的能力，能够显著提高疫苗的效力。该疫苗已经在1期和2期人体临床试验（NCT02657161和NCT02956421）中进行了安全性和免疫原性的评估，目前已获准在新加坡、巴基斯坦和菲律宾进行3期临床试验。

参考文献：YuP,LiuY,TaoX,HeY,LiuQ,WangB,ZhengH,ZhangN,BiS,ZhuW,ZhangY.Potentialoptionforrabiespost-exposureprophylaxis:NewvaccinewithPIKAadjuvantagainstdiverseChineserabiesstrains.Vaccine.2023Oct9:S0264-410X(23)01161-1.doi:10.1016/j.vaccine.2023.10.001.Epubaheadofprint.PMID:37821317返回搜狐，查看更多

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